A bilirrubina direta (conjugada) reage com o sal de diazónio 2,4-diclorofenildiazónio (2,4-DPD) na presença de ácido sulfâmico para formar azo-bilirrubina, podendo este complexo colorido ser medido fotometricamente a 546 nm. Das duas fracções de bilirrubina no soro - bilirrubina-glucuronido (conjugada) e bilirrubina livre ligada à albumina (não conjugada) - apenas a primeira reage diretamente, enquanto a bilirrubina livre reage após ter sido deslocada da proteína (albumina) por um acelerador. A diferença entre as duas medições: bilirrubina total (com acelerador) e bilirrubina direta (sem acelerador) permite calcular a bilirrubina indireta. Os termos "bilirrubina direta" e "indireta" referem-se exclusivamente às caraterísticas da reação na presença ou ausência de um acelerador ou solubilizante e são apenas equivalentes aproximados das duas fracções de bilirrubina.
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