O Fe (II) de todas as formas de hemoglobina, com exceção da sulfohemoglobina, é oxidado ao Fe (III) da metemoglobina que, por sua vez, reage com cianeto ionizado (CN-) para formar cianometemoglobina, um derivado estável que absorve a 540 nm. A intensidade da cor produzida é proporcional à concentração de hemoglobina total na amostra.
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