A circulação de 25-hidroxivitamina D (25-OH-D) é amplamente reconhecida como o melhor indicador do estado da vitamina D. Na circulação sanguínea os dois principais metabolitos de vitamina D são a vitamina D3 25-OH e a vitamina D2 25-OH. 25-OH-D3 é principalmente derivado da vitamina D3 produzida pela luz solar na pele, enquanto que 25-OH-D2 é derivado de plantas da dieta. Existem actualmente dois tipos principais de métodos utilizados rotineiramente para medir 25-OH-D: métodos baseados na separação cromatográfica seguida de detecção directa não imunológica e imunoensaios competitivos. A maioria dos imunoensaios depende de um anticorpo que pode detectar tanto a Vitamina D2 como a Vitamina D3 25-OH em conjunto e dá resultados totais. Mas a proporção de detecção de 25-OHD2 é variável.
Dois métodos não imunológicos para detecção directa estão actualmente disponíveis: cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e cromatografia líquida de espectrometria de massa tandem (LC-MS/ MS). Os métodos cromatográficos são capazes de medir 25-OH-D2 e 25-OH-D3 independentemente com excelente precisão e sensibilidade.
Por outro lado, há muitos estudos e trabalhos científicos que mostram a inexactidão de medir a Vitamina D total com imunoensaios comerciais sem separar e medir individualmente os metabolitos de Vitamina D2 e Vitamina D3. Recomenda-se que qualquer ensaio de 25-OH-D em laboratórios clínicos deve medir igualmente 25-OH-D2 e 25-OH-D3, a fim de reportar um valor total de 25-OH-D. Os imunoensaios avaliados medem o total 25-OH-D (ambos 25-OH-D3 e 25-OH-D2), mas a reacção cruzada com 25-OH-D2 e 25-OH-D3 difere de 52 a 100% em métodos diferentes.
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